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色譜柱的使用壽命，除了與所分析的樣品和流動相及使用頻率有關系外，zui主要的是與日常的維護密切相關。為延長色譜柱的使用壽命，維護您的利益，請仔細閱讀此部分。
色譜柱的使用壽命主要是柱效和柱壓兩個指標來衡量，如果一支色譜柱柱效太低或柱壓太高，通常被認為該色譜柱已經(jīng)結束。因此，延長色譜柱使用壽命的關鍵是，消除引起柱效下降和柱壓升高的因素。以下是色譜柱的日常維護方法：
一、流動相的PH應在使用的范圍內
色譜柱除反相氰基柱PH1.5-9.0外，其反相色譜柱的PH范圍均為1.5-10，由于填料中存在Si-C和Si-O鍵，流動相超過其PH范圍將會導致硅膠基質流失和鍵合相碳鏈斷裂，使柱效下降，使用壽命變短。由于流動相的PH 控制不當而對色譜柱造成的損害，通常很難使色譜柱恢復，因此必須認真對待，嚴格控制流動相的PH值。
二、去除樣品和流動相中的固體顆粒
樣品和流動相中含有的固體顆粒物質會堵塞色譜柱篩板，篩板被堵住不僅會引起柱壓的升高，而且也會引起柱效下降，因為篩板的堵塞會引起液流不均，導致色譜峰型拖尾、變寬，從而使柱效下降。因此，建議使用超純水和色譜純試劑，在分析樣品前對樣品進行針筒過濾，流動相過0.45μm濾膜。
三、使用保護柱或在線過濾器
樣品和流動相經(jīng)過濾后并不能*消除固體顆粒物質，因為泵的磨損、密封圈和管路的老化也會產(chǎn)生固體顆粒物質，這些固體顆粒被流動相帶入色譜柱，堵塞篩板，導致柱壓升高、柱效下降。保護柱和在線過濾器上都有篩板，其孔徑與色譜柱孔徑相同，因此可以阻止固體顆粒物質到達色譜柱，有效防止色譜柱篩板的堵塞。由于柱壓升高在分析故障中占很大 比例，因此，除對樣品和流動相進行過濾外，建議您在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器。
如果確認色譜柱柱壓升高是由于進樣端篩板被堵引起的，可選擇以下方式進行補救：
1、先在色譜柱前加上保護柱或在線過濾器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向沖色譜柱180min。
2、先在色譜柱進樣端加上保護柱或在線過濾器，然后反向使用。
四、正確使用緩沖鹽
緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機溶劑，因此緩沖鹽使用不當會使其析出，堵塞填料基質上的微孔和顆粒間的空隙，使填料板結，柱壓上升；同時阻礙了基質上鍵合的碳鏈自由舒展，使色譜柱的保留能力下降，柱效降低。緩沖鹽析出后，去除非常困難，因此，正確的使用緩沖鹽對延長色譜柱使用壽命非常重要。
正確使用緩沖液的目的是防止緩沖鹽析出，因此正確使用緩沖鹽的方法可歸結為一句話：使用前要過濾，使用后要沖洗。具體方法如下：
1、等度條件：使用緩沖鹽前和使用后需用過渡流動相以1.0ml/min流速沖洗60min；使用后去除緩沖鹽的另一個方法是用過渡流動相以0.2ml/min流速沖洗色譜柱過夜。
2、梯度條件：用含有緩沖鹽的流動相跑梯度之前，用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1.0ml/min流速沖洗60min，再用該過渡流動相以1.0ml/min沖洗色譜柱120min。含緩沖鹽流動相的梯度設定應盡量平緩，以避免梯度過程中緩沖鹽析出。
注意：過渡流動相是指有機相和水相的組成與分析流動相相同，區(qū)別只是過渡流動相不含緩沖鹽。
3、緩沖鹽析出的補救方法：
1）方案1：用甲醇/20/80以1.0ml/min流速35攝氏度條件下反向沖洗色譜柱120min
2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過夜。
五、防止強保留物質在色譜柱上存留
強保留物質和大分子化合物在色譜柱中累積，對樣品中的化合物產(chǎn)生額外的保留行為，不僅引起峰型變寬、拖尾，使柱效下降，同時也會引起保留時間的變化，累積到一定程度時還會導致柱壓升高。由于強保留物質和大分子化合物對色譜分離的影響是一個累積效應，需要一定的時間才會體現(xiàn)出來，但對許多藥品特別是復雜樣品而言，很難判斷其是否是含有強保留物質，因此要防止強保留物質的累積，需要在每天的日常維護中用純甲醇清洗色譜柱。
清洗方法：
1、未使用緩沖鹽：每天分析完成后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后再用甲醇或反向沖洗色譜柱60min。
2、使用過緩沖鹽：分析完成后，先用上述方法除去緩沖鹽，然后在用純甲醇或乙氰反向沖洗色譜柱60min
3、補救方法：
水——乙氰——（或異丙醇）——乙氰——水
每一步以1.0ml/min流速反向沖洗色譜柱60min。
C18色譜柱的選用、保養(yǎng)與維修
據(jù)統(tǒng)計，近80%的有機物及無機物可以用液相色譜法進行分離，其中反相色譜中的C18色譜柱是液相色譜中zui為常用的一類色譜柱。下面就C18色譜柱的選用、保養(yǎng)與維修作一介紹。
1、C18色譜柱的選用
C18的選用主要考慮2個問題，即柱填料和柱規(guī)格對色譜柱的影響。
1.1 C18柱的填料對色譜柱的影響 柱填料的物理性能對填料色譜行為有重要影響。填料主要的物理性能包括如下：顆粒度、孔徑、孔體積、鍵合相化學、含碳量及烷基化處理。
(1)顆粒度是指柱填料的顆粒直徑的大小。實際上色譜柱上所標的粒徑是一個平均值。如粒徑“5μm”并不是柱中填料所有的顆粒直徑都是5μm，實際上有一個顆粒分布度。這種分布度對柱反壓及柱效有重要作用。一般來說，平均顆粒度越小，顆粒分布度越小，色譜柱效越高，反壓亦越高。目前C18柱填料粒徑在4～10μm之間。
(2)孔徑是指填料顆粒間的孔間隙。一般所說的孔徑是指填料的平均孔徑。球形填料裝柱后平均孔徑分布比較窄，柱床結構均勻，柱效高，重現(xiàn)性好；無定形填料平均孔徑分布較寬，柱床結構不均勻，流動相線性速度不均勻，譜帶擴寬。平均孔徑的大小對分離大分子化合物有較大的影響，在分離含有較大分子的樣品時可能會有分子排阻效應，或產(chǎn)生吸附效應從而影響定量的回收率及準確度。因而在用反相色譜分離諸如蛋白或多肽樣品時應考慮選用大孔徑(如30 nm)的反相柱填料。孔體積作為硅膠多孔性的參數(shù)，在分離分析較大分子化合物時可作參考，選用較大孔體積的反相柱填料。
(3)化學鍵合相填料在液相色譜法中占有極重要的地位。它可以鍵合極性較大的有機基團，采用極性較小的溶劑作流動相。亦可鍵合極性較小的有機基團，選用極性較大的溶劑作流動相。C18色譜柱是以硅烷化鍵合型(Si-O-Si-C)存在的，這類鍵合反應目前應用zui為普遍。如以十八烷基與全多孔型硅膠M-Porasil-C18反應生成烷基化學鍵合相，商品名為M-Bondapak-C18。
(4)碳含量即填料中的含碳量。傳統(tǒng)的測量技術是將填料加熱到碳氫鍵斷裂，然后通過測定損失的重量或形成的二氧化碳來計算碳含量?？梢酝ㄟ^增加碳鍵的長度或增加鍵合密度來增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。鍵合相的色譜行為與鍵合密度有關，也與硅膠的密度及填料的表面積有關，填料的密度越高，填柱所需的硅膠量越多，柱子的含碳量也越高。如果用2種不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行為將明顯不同。因此，單獨以碳含量來預測色譜行為是不夠的。
(5)C18硅烷化試劑是一個大于2 nm大分子，因此會與已鍵合在相鄰的硅醇基上的C18硅烷化試劑產(chǎn)生嚴重的立體位阻。其結果導致在硅膠表面有大量的殘留硅醇基沒有與硅烷化試劑反應，這些極性的硅醇基在一定色譜條件下會與堿性化合物相互作用引起峰形拖尾，從而可影響定量分析結果。這些問題在一定程度上可以通過烷基化處理加以克服。烷基化處理是在鍵合相上完成的獨立反應，以減少在硅膠表面的硅醇基。烷基化處理采用小分子的試劑，其空間位阻遠小于C18基團。大多數(shù)固定相僅有30%可覆蓋的鍵合位置。據(jù)報道，通過某些極活躍的化學試劑及特殊的反應條件，zui高的覆蓋量可達50%。很好地了解硅膠鍵合相的物理特性將有助于在液相色譜的反應中選擇合適的色譜柱。表面上看C18柱雖然化學官能團相同，而實際上不同品牌的C18柱性能可能有很大差別，從而產(chǎn)生不同的分離結果。
1.2 C18柱的規(guī)格對色譜柱的影響 柱填料的選擇關系到色譜分離的可能性，而柱規(guī)格的選擇直接影響分析速度、分離能力、檢測能力及每次分析的溶劑消耗等。柱規(guī)格包括兩方面：柱內徑和柱長度。柱內徑，分析型一般為2～6 mm,制備型20 mm，大者可達80 mm；柱長度，分析型5～30 cm，制備型15～50 cm。一般來說，柱內徑不影響分離度與分析時間的關系。今天，柱技術已發(fā)展到不同柱內徑的柱子能夠具有相同的性能。不同內徑的柱子又各具特點，對相同的分析時間和分離度來說，內徑大的柱子比內徑小的柱子多消耗溶劑。另一方面，較小內徑的柱子對相同的檢測信號來說所需樣品量亦較少。因此，在樣品量有*，可使用小內徑柱。柱長度增加雖可改善分離效果，但阻力也隨之增加，必須提高入口壓力。柱壓是同時影響增加分離度和減少分析時間的主要障礙。分離度、分析時間及柱壓三者相互制約，選擇好其中兩者，則第3個因素也就選好了。長柱可以給出高分離度，短柱可提供快速分離，我們可以根據(jù)樣品情況去選用合適的色譜柱。
1.3 C18柱選用的基本原則 (1)選用經(jīng)過烷基化處理封口的填料可防止堿性化合物的拖尾現(xiàn)象。(2)選用含碳量高的柱子，增加保留值。(3)選用較短的柱子(如15 cm，7.5 cm)。(4)選用小顆粒度的填料。(5)對分子量大的組分選用大孔徑填料的柱子。
2、C18色譜柱的日常使用與保養(yǎng)
在日常分離分析工作中，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命。下面介紹C18柱在日常使用過程中應注意的事項。
(1)柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置1根柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
(3)如使用柱溫控制裝置時，應注意在通入流動相后才能升溫。
(4)流動相使用前需進行脫氣處理，以免降低柱效和影響檢測等。樣品溶液需經(jīng)適當?shù)那疤幚砑斑^濾，以減少柱污染和堵塞。
(5)在更換流動相種類時，應注意溶劑的互溶性，防止發(fā)生鹽析現(xiàn)象。
(6)柱子的實際操作壓力應低于填裝時的zui高壓力，在zui高壓力一半以下。一般不超過20 593.965～29 419.95 kPa。在低壓力(≤14 709.975 kPa)的范圍使用，可使柱保持長時期的高柱效。
(7)C18色譜柱屬非極性鍵合相色譜柱，流動相的pH值應嚴格控制在2～7之間，以免損壞柱子。
(8)在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5 h以上，以除去色譜柱內的雜質。
(9)如果流動相中有鹽類，首先用水充分清洗。如果是胺類(如*胺類或四丁基胺類)添加到流動相中，要用50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶劑沖洗，不要只用水沖洗。
(10)C18一般用100%甲醇作為保存溶劑，以防柱子干裂而損壞。嚴禁水或緩沖溶液長時間在色譜流路中保留。
(11)選用合適的C18保護柱，以保護分析柱免受雜質顆粒及不可逆吸附的干擾物的影響。保護柱內裝填料顆粒度應與分析柱填料的顆粒度盡量一致。
(12)柱的保存期不宜太長。短期不用的C18柱，用甲醇沖洗30～60 min，然后將柱兩端密封。較長期不用的柱子，一是采取定期沖洗，再密封的方法；二是在沖洗后，柱兩端各裝1只有一定容量的灌滿甲醇的容器(只裝一端也可)，以補充在較長存放期間柱內溶劑的蒸發(fā)。
3、C18色譜柱的維修
色譜柱在日常使用過程中，盡管保護嚴格，樣品和流動相盡管經(jīng)過前處理，但經(jīng)過長時間的使用，仍然難以*避免柱子受到污染，固定相流失、板結、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通過維修，使部分柱效恢復。
3.1 柱污染再生技術 色譜柱污染后，可以用合適的溶劑沖洗，使柱效再生。C18柱常規(guī)的再生洗滌方法是：分別用甲醇、甲醇/水各60 mL依次通過色譜柱，再用100%甲醇60 mL平衡色譜柱后封存，柱效將恢復正常。必要時，根據(jù)柱污染性質(如有機污染、鹽類污染等)，采用0.05 mol/L H2SO4、0.5 mol/L H3PO4或0.1 mol/L EDTA鈉鹽沖洗，然后再用水沖洗，zui后用100%甲醇平衡色譜柱后封存。對于嚴重污染的C18柱，可采用水、甲醇、乙烷依次沖洗后，按順序倒過來再沖洗1次，每次所用溶劑60 mL，不接檢測器，zui后用100%甲醇平衡色譜柱封存。
3.2 柱污染的修復 在柱污染再生無效或已知柱污染嚴重時，可以采用柱修補的方法解決，但柱污染深度不宜超過5 mm。方法是將特制小鏟將污染部分挖去，再用與柱填料相同的固定相與流動相混合制成漿狀，然后將漿狀固定相仔細補入被挖去的部分(盡量使后填補的固定相接近原裝的緊密程度)，修平端面即可。修好的柱子如果柱頭兩端的篩板的孔徑是一致的，可將柱子顛倒過來使用一般時間，目的是借助流動相沖洗作用，恢復柱床緊密程度。
3.3 柱塌陷的修復 柱塌陷的原因很多。對于塌陷不太嚴重時，如果柱頭兩端的篩板孔徑是一致的，可將柱顛倒使用一般時間，即可恢復性能。當塌陷嚴重(5 mm左右)時，可采用柱污染的修復方法修補即可。
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